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温馨提示：

1）细胞对腐草霉素的敏感性受pH值影响，如pH值越高，敏感性越高；另外，对于高渗透压培养基如原生质体再生用的培养基，腐草霉素的活性会明显降低2-3倍。因此也可能通过使用低盐培养基来降低腐草霉素使用量。

2）使用前，需将低温存放的腐草霉素置于室温回温，之后低速充分混匀。

操作步骤

1. 大肠杆菌

携带bleomycin抗性基因如Sh ble，Tn5的质粒，一旦转化进入大肠杆菌受体菌如HB101，DH5a，MC1061，赋予其腐草霉素抗性。

腐草霉素抗性的转化子可以在添加5 μg/mL Phleomycin的低盐LB琼脂培养基（Yeast extract 5 g/L，Tryptone 10 g/L，NaCl 5 g/L，Agar 15 g/L，pH 7.5）中进行筛选。加有腐草霉素的平板可于4℃稳定保存1个月。

2. 酵母菌

酿酒酵母的腐草霉素抗性转化子可在添加10 μg/mL Phleomycin的YEPD培养基中进行筛选。

实验步骤：按常规方法进行酵母细胞转化，一旦DNA进入细胞后，用YEPD培养基稀释细胞并置于摇床上培养6 h或过夜，使其抗性性状得以表达。之后将细胞冰浴1 h并涂布培养在添加10 μg/mL Phleomycin的YEPD（pH 7.0）固体培养基上。

3. 真菌

根据转化子对Phleomycin 的敏感性不同，在添加有10-50 μg/mL腐草霉素的再生培养基内进行筛选。先将细胞在4℃孵育过夜然后置于生长温度培养，可提高其对抗生素的敏感性。

4. 植物细胞

根据植物类型不同，选择5-25 μg/mL Phleomycin进行转化子筛选。

5. 哺乳动物细胞

5-50 μg/mL Phleomycin，推荐先通过建立灭杀曲线来确定*佳浓度。与G418做比较，可能需要更长的时间来杀死细胞或者使细胞从平板上脱落，尤其当细胞处于高密度的情况。

依细胞系不同，通常需要5~21天来挑选具腐草霉素抗性的稳定转染细胞。

注意事项：

2. 腐草霉素有毒，避免直接接触皮肤，不可吞服。酸性或碱性pH，或次磷酸钠中会即刻失效。

<span font-size:14px;"="">3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅供科研使用，不可用于临床诊断应用或其他用途。